4種楠木AFLP反應體系優(yōu)化建立

摘要： 采用核酸電泳緩沖液(TNE)結合十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)提取的高質量楠木Phoebe基因組脫氧核糖核苷酸(DNA)可滿足擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)分析的要求。利用浙江楠Phoebe chekiangensis基因組DNA優(yōu)化建立楠木AFLP反應體系如下:酶切反應300 ng基因組DNA,0.3μL緩沖液4,0.3μL牛血清白蛋白(100×BSA),50nkat EcoRΙ,25 nkat MseΙ,雙蒸水加至30.0μL放置37℃恒溫箱酶切4 h,聚合酶鏈式反應(PCR)儀上65℃15min;連接反應20.0μL酶切產物,2.5μL T4緩沖液,666.8 nkat T4連接酶,5 pmol EcoRΙ接頭,10 pmol MseΙ接頭,雙蒸水加至25.0μL,16℃連接過夜(10～14 h);預擴增反應2.0μL連接產物,2.0μL 10×緩沖液,31.25nmol鎂離子,16.67 nkat TaqDNA聚合酶,4 pmol脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP),預擴增引物(E+A,M+C)各6 pmol,雙蒸水加至20.0μL;選擴增反應稀釋40倍的預擴產物2.0μL,2.0μL 10×緩沖液,31.25 nmol鎂離子,4 pmol dNTP,16.67 nkat TaqDNA聚合酶,選擴增引物(M+CNN)15 pmol,選擴增引物(E+ANN)12 pmol,雙蒸水加至20.0μL。利用上面體系在64對選擴引物中篩出13對適于浙江楠AFLP分析的最佳引物組合。 （共8頁）